Il Museo dell'Opera nasce nel 1869. I suoi locali hanno sede nella tamponatura delle prime tre campate della navata destra di quello che originariamente doveva essere il "duomo nuovo". Al suo interno sono raccolti capolavori assoluti della pittura toscana, dai primitivi del Duecento e Trecento fino alle opere del Seicento, ma indubbiamente il nucleo principale e di maggior pregio è costituito dalla straordinaria Maestà e dalla superba Vetrata, opere provenienti dalla cattedrale e realizzate da Duccio di Buoninsegna tra il 1290 e il 1311.